视网膜类器官-研究RP的新型利器

采患者及一正常对照的外周血，用血液单核细胞进行iPSC的诱导（图2A）。对来自患者和对照组的3个iPSC系检测了AP染色和多能性标记（图2B和C）。三系分化表明，来自患者和对照组的iPSC能够分化为三个胚层（图2D）。以上结果证明了患者特异性诱导多能干细胞的成功构建。

CRX在光感受器前体细胞和成熟光感受器中表达，NRL在视杆前体细胞和成熟视杆细胞中表达。在ROs早期，CRX和NRL作为光感受器前体细胞和视杆前体细胞的标记物。D60时CRX表达在患者和对照中无明显差异，D120时NRL表达无明显差异(图3B)。光感受器细胞特异性标记CRX在D60时在内层和外层均有表达(图3B)，在D105时主要在外层(图3C)，表明其具有类似于体内早期视网膜的层次结构。RCVRN的表达大约在D60时出现，并随着ROs的发展而增加(图3C)。在D105时，大多数CRX⁺感光细胞与RCVRN共表达(图3C)，这与之前的报道一致。免疫染色分析显示，ROs具有视网膜发生发展的过程，在D120前，患者和对照组的视网膜前体细胞或感光细胞无明显差异。然而，随着RO的发展，患者与对照组ROs视杆细胞的标记(RHO)和视杆双极细胞的标记(PKCɑ)在D180时有明显的差异(图3C)。因此，患者ROs构建成功，并表现出明显的视杆细胞缺陷。

为了研究PDE6B的突变c.694G>A对转录的影响。对患者和对照组的ROs进行整体的RNA测序，从中期(D90、120、150和180)到晚期(D230)。与其他测序时间点相比，在D230时，患者和对照组之间共发现2578个差异表达基因（图4A）。而在这些基因中，有968个在其他时间点中没有（图4B）。这一结果与之前的形态学和免疫染色结果一致，说明在中期患者的ROs中出现了轻微的改变。此外，相关分析也证实了患者ROs在D230时与其他时间段ROs的差异(图4D)。这些结果提示PDE6B的突变c.694G>A可能导致迟发性的视网膜疾病，与RP临床表型一致。

对照组ROs中，RHO⁺视杆细胞和M-视蛋白⁺视锥细胞主要位于外层，呈外节段样结构，说明感光细胞形态成熟。而在患者ROs中，RHO和M-视蛋白多出现在内层，且形态未成熟（图5B）。RCVRN阳性细胞和DAPI很清楚地显示外层结构(图5C)。TUNEL阳性细胞很少，在D180或D230时在两组中也未见明显差异（图5C）。3个ROs(每个6张)的统计分析表明，对照组ROs的内、外层视杆细胞比例明显高于患者ROs（图5D）。因此，以上结果提示PDE6B的突变解除了ROs中期视杆细胞标记物的表达限制，并特异性地破坏了ROs晚期视杆细胞的成熟，细胞死亡可能不是导致视杆细胞定位改变的主要原因。

在患者和正常的ROs上能看到突触明显不同的的表达模式（图7A）。在对照组ROs中，大多数突触位于外核层两个顶端区域上。而患者ROs中则向细胞质扩散（图7A）。另外在正常ROs中能发现突触结构在视杆细胞的末端形成（图7B和C）。而患者ROs中没有发现相似结构。并通过ARL13B的表达来检测连接纤毛的结构（图7D）。发现患者的ROs中纤毛数量明显减少（图7E）。基于以上结果，在PDE6B突变的ROs中，cGMP水平升高可能与从内层到外层的视杆细胞迁移受损以及光感受器细胞中突触和连接纤毛的形成受阻有关。